Caractérisation moléculaire et efficacité immunitaire du fructose

Parasites & Vecteurs volume 16, Numéro d'article : 169 (2023) Citer cet article

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Les tiques sont des ectoparasites hématophages obligatoires qui transmettent une variété d'agents pathogènes aux humains, à la faune et aux animaux domestiques. La vaccination est une méthode efficace et respectueuse de l'environnement pour lutter contre les tiques. La fructose-1,6-bisphosphate aldolase (FBA) est une enzyme importante du glycométabolisme qui est un vaccin candidat contre les parasites. Cependant, la protection immunitaire de la FBA chez les tiques n'est pas claire.

Le cadre de lecture ouvert (ORF) de 1092 pb de FBA de Haemaphysalis longicornis (HlFBA), codant pour une protéine de 363 acides aminés, a été cloné à l'aide de la méthodologie PCR. Le vecteur d'expression procaryote pET32a(+)-HlFBA a été construit et transformé dans des cellules de la souche Escherichia coli BL21(DE3) pour l'expression des protéines. La protéine HlFBA recombinante (rHlFBA) a été purifiée par chromatographie d'affinité, et les résultats du Western blot ont suggéré que la protéine rHlFBA était immunogène.

Les résultats du dosage immuno-enzymatique ont montré que les lapins immunisés avec le rHlFBA produisaient une réponse immunitaire humorale spécifique au rHlFBA. Un essai d'infestation de tiques a indiqué que, par rapport aux tiques du groupe thiorédoxine (Trx) marqué à l'histidine, le poids des tiques engorgées et la ponte des tiques femelles et le taux d'éclosion des œufs de celles du groupe rHlFBA étaient réduits de 22,6 %, 45,6 % et 24,1 %, respectivement. Sur la base de l'effet cumulatif de ces trois paramètres, l'efficacité immunitaire globale du rHlFBA a été estimée à 68,4 %.

Le FBA est un candidat vaccin anti-tiques qui peut réduire considérablement le poids des tiques engorgées, la ponte et le taux d'éclosion des œufs. L'utilisation d'enzymes impliquées dans le métabolisme du glucose est une nouvelle stratégie dans le développement de vaccins anti-tiques.

Les tiques, qui sont des arthropodes hématophages obligatoires, sont des vecteurs majeurs d'agents pathogènes chez l'homme et les animaux dans le monde [1]. Les tiques et les microbes qu'elles transmettent constituent des menaces importantes pour la santé humaine et vétérinaire [2]. Haemaphysalis longicornis (Acari : Ixodidae) est une espèce de tique originaire d'Asie de l'Est et s'est établie en Australie, en Nouvelle-Zélande et dans plusieurs îles du Pacifique [3]. Il transmet des agents pathogènes tels que Theileria uilenbergi, Babesia motasi, Rickettsia hebeiii et Anaplasma phagocytophilum [4,5,6,7]. Il est également le vecteur d'une fièvre sévère à virus du syndrome de thrombocytopénie (SFTSV) qui met en danger la santé humaine et animale [8]. Il est donc impératif de développer un anti-H. vaccin longicornis [9, 10].

Galay et al. ont évalué deux types de ferritines protéiques liant le fer de H. longicornis (HlFER), un HlFER1 intracellulaire et un HlFER2 sécrétoire, comme vaccins anti-tiques [11]. Les résultats du Western blot ont démontré que les anticorps réagissaient de manière croisée avec le HlFER recombinant (rHlFER) et réagissaient également avec les HlFER natifs. Une expérience de provocation de tiques a démontré que les tiques nourries avec le lapin inoculé avec rHlFER2 avaient un poids d'engorgement inférieur à celui des tiques du groupe témoin. La ponte et l'éclosion ont été réduites dans les deux groupes inoculés avec rHlFER. L'efficacité vaccinale de rHlFER1 et rHlFER2 était de 34 % et 49 %, respectivement [11]. Dans une autre étude, le cadre de lecture ouvert (ORF) de la subolésine de H. longicornis (HlSu) a été identifié et le HlSu recombinant (rHlSu) exprimé dans Escherichia coli [12]. Les lapins immunisés avec rHlSu ont produit une réponse immunitaire. Dans le groupe rHlSu-immunisé, le poids d'engorgement et la ponte des tiques femelles étaient significativement plus faibles que dans le groupe témoin. L'efficacité calculée du vaccin a été estimée à 37,4 % [12]. Dans une étude ultérieure, Wang et al. clone le gène homologue de la lipocaline de H. longicornis (HlLIP) dans pET-32(a+) pour obtenir la protéine recombinante (rHlLIP) ; l'immunogénicité du RHlLIP a été confirmée par western blot [13]. Un essai d'immunisation sur des lapins infestés par H. longicornis a montré que les anticorps dirigés contre la protéine rHlLIP réduisaient le poids d'engorgement, la ponte et l'éclosion (l'efficacité vaccinale de la protéine rHlLIP était de 60,17 %). Cependant, à ce jour, un anti-H. Le vaccin longicornis n'est pas disponible actuellement, il est donc important de dépister un antigène protecteur efficace contre l'infestation par H. longicornis.

La fructose-1,6-bisphosphate aldolase (FBA) est une enzyme qui catalyse le fructose-1,6-bisphosphate en glycéraldéhyde-3-phosphate et dihydroxyacétone phosphate ou la réaction de condensation inverse de l'aldol alcool [14]. La FBA, qui peut induire des réponses immunitaires dans de nombreuses maladies infectieuses [15], peut également être utilisée comme vaccin à large spectre contre de nombreux agents pathogènes [16,17,18,19,20]. Dans une étude, des souris inoculées avec du FBA recombinant (rFBA) + adjuvant de Freund ont acquis une protection immunitaire contre la provocation par Streptococcus pneumoniae [21]. Comparé à l'adjuvant de Freund seul, le rFBA + adjuvant de Freund a augmenté la prolifération des lymphocytes T CD4+ mémoire chez la souris et augmenté significativement les taux de survie. Les sérums de souris anti-rFBA ont également protégé de manière significative les souris contre une provocation létale à S. pneumoniae par rapport aux sérums pré-immuns [21]. Ces données suggèrent que le rFBA est un vaccin candidat pour la protection contre S. pneumoniae. McCarthy et al. vérifié que Onchocerca volvulus FBA (OvFBA) est immunogène. Lorsque l'OvFBA recombinant a été testé pour son efficacité protectrice chez la souris, la survie des larves a été réduite de 50 % [16]. Ces données appuient une étude plus approfondie de cette enzyme en tant que vaccin candidat dans des modèles animaux.

Dans la présente étude, nous avons cloné l'ORF de FBA de H. longicornis (HlFBA) et utilisé E. coli pour exprimer la protéine recombinante HlFBA (rHlFBA). Nous avons ensuite analysé son efficacité de protection immunitaire en immunisant des lapins. Les résultats indiquent que H1FBA pourrait être un vaccin utile contre l'infection à H. longicornis.

Des tiques adultes de H. longicornis ont été prélevées sur des moutons de la réserve naturelle nationale de Xiaowutai de la province du Hebei en mai et envoyées au laboratoire comme décrit précédemment [22]. Pendant la phase non parasitaire, les tiques ont été maintenues dans un incubateur ; pendant la phase parasitaire, les tiques ont été nourries sur les oreilles de lapins blancs de Nouvelle-Zélande. La prochaine génération de tiques adultes a été collectée à différents stades de développement pour les expériences. Toutes les expérimentations animales ont été réalisées selon les protocoles approuvés du Comité d'éthique animale de l'Université normale du Hebei (#2021LLSC035).

L'ARN total des femelles adultes de H. longicornis a été extrait à l'aide du réactif TRIzol (TransGen, Pékin, Chine) pour une synthèse supplémentaire d'ADN complémentaire (ADNc) comme décrit précédemment [23]. L'ORF du gène H1FBA (HlFBA) a été amplifié et cloné à l'aide des amorces 5'-ATGGCTGGCCACTTCAC-3' et 5'-TCAGTACTCGTGGTTTTTGATA-3'. HlFBA a été obtenu par cycle PCR consistant en les étapes suivantes : pré-dégénérescence à 94 °C pendant 3 min ; 30 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 30 s, recuit à 60 °C pendant 30 s et extension à 72 °C pendant 60 s ; une extension finale à 72 °C pendant 10 min. Les produits de PCR obtenus ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose, suivi de la récupération et de la ligation des bandes cibles dans un vecteur pEASY-T1, qui a ensuite été transformé dans des cellules TRANS-T1 (TransGen) pour le séquençage. La séquence de gène correcte a été traduite dans la séquence d'acides aminés, suivie d'un alignement de séquences multiples à l'aide de DNAMAN 8.0 (Lynnon Biosoft, Québec, ONT, Canada).

Les profils de transcription de HlFBA de différents stades de développement (œuf, larve, nymphe et adulte) et de différents organes (glandes salivaires, intestin moyen, ovaire et tubules malpighiens) de tiques femelles ont été estimés par PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR). Des amorces spécifiques de HlFBA ont été conçues (amorce directe : 5′-TCTGACCAAGAGGTGCGT-3′ ; amorce inverse : 5′-GTAGCGAGGCGAGGAC-ATT-3′). L'expression relative du gène de la β-actine de H. longicornis (AN AY254898) a été utilisée pour normaliser les données d'expression de HlFBA [24]. Les données d'expression génique ont été calculées par la méthode 2−ΔΔCt [25]. Toutes les analyses ont été effectuées en utilisant trois répétitions techniques et trois répétitions biologiques.

Les amorces contenant les sites de restriction EcoRI et HindIII (amorce directe : 5'-GAATTCATGGCTGGCCACTTCAC-3' ; amorce inverse : 5'-AAGCTTTCAG-TACTCGTGGTTTTTGATA-3') ont été utilisées pour amplifier HlFBA par PCR. Les produits de PCR ont été séparés par électrophorèse sur agarose et le gène cible a été récupéré à l'aide d'un kit de récupération de gel d'ADN (BioTeke Corp., Pékin, Chine) et inséré dans le plasmide d'expression procaryote pET-32a(+) (TransGen), nommé pET- 32a(+)-HlFBA. Pour l'expression de rHlFBA, les plasmides ont été transformés dans des cellules de la souche E. coli BL21(DE3) (Takara Bio Inc., Shiga, Japon) et les cellules propagées dans 10 ml de bouillon Luria-Bertani (LB) contenant 10 μg/ml d'ampicilline ( TransGen) pendant une nuit à 37 °C et 200 tr/min, après quoi ils ont ensuite été utilisés pour inoculer des cultures de 100 ml. La protéine rHlFBA a été induite par 0,5 mM d'isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à 25 °C, et les surnageants des cultures cellulaires ont été purifiés par élution le long d'un gradient d'imidazole (20 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM et 500 mM) dans Ni. Résine de chromatographie Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare, Chicago, IL, USA). La protéine rHlFBA a été quantifiée par la méthode de Bradford [26]. La protéine thiorédoxine (Trx) marquée à l'histidine exprimée par le plasmide pET-32(a+) a été purifiée en utilisant la procédure ci-dessus.

Dix tiques femelles à jeun ont été broyées dans de l'azote liquide et transférées dans un tube contenant 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 0,1 M. Après centrifugation à 13 000 tr/min pendant 10 min à 4 ˚C, 500 μg de protéine de tique, mélangés à l'adjuvant complet de Freund, ont été injectés à un lapin. Cela a été suivi de deux injections de 500 μg de protéine de tique mélangées à l'adjuvant incomplet de Freund à des intervalles de 2 semaines. Les sérums ont été collectés au jour 14 après la dernière immunisation et purifiés par la méthode de précipitation à l'acide caprylique-sulfate d'ammonium pour obtenir de l'anti-H de lapin. sérum longicornis.

Un échantillon de 20 μg de protéines totales, y compris un marqueur protéique précoloré (TransGen), du rHlFBA purifié et des E. coli induits par IPTG contenant pET-32a(+)-HlFBA, a été chargé sur une électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium à 12 % (SDS -PAGE), colorés au Coomassie Brilliant Blue et transférés sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF). Après blocage dans du TBS-Tween-20 (TBST) contenant 5 % de lait écrémé à 25 °C pendant 3 h, la membrane a été incubée avec de l'anti-H de lapin dilué au 1/2000. sérum longicornis ou sérum de lapin négatif pendant la nuit, respectivement. Les membranes ont ensuite été lavées avec du TBST et incubées avec de l'immunoglobuline G anti-lapin de chèvre diluée à la peroxydase de raifort (HRP) diluée au 1: 2000 (IgG; Proteintech, Chicago, IL, USA) pendant 2 h. Les signaux positifs ont été détectés à l'aide du substrat à durée prolongée SuperSignal® West Dura (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis) et photographiés à l'aide d'un système d'imagerie par chimioluminescence (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, États-Unis).

Les lapins ont été répartis au hasard dans le groupe PBS, le groupe Trx et le groupe rHlFBA (6 lapins par groupe). Dans le groupe expérimental, 0,5 ml de rHlFBA (1 μg/μl) mélangé à 0,5 ml d'adjuvant complet de Freund a été injecté dans le dos des lapins au jour 0, et la même dose de rHlFBA mélangé à l'adjuvant incomplet de Freund a été injectée dans le dos des lapins. au jour 14 et au jour 28, respectivement. Dans le groupe témoin, 0,5 ml de PBS ou de protéine Trx (1 μg/μl) mélangés à l'adjuvant ont été injectés selon le même protocole dans le dos des lapins.

Avant la première immunisation et aux jours 7, 14, 21, 28 et 35 après la première immunisation, du sang a été prélevé des oreilles de lapins pour l'analyse du niveau d'anticorps et la détermination des valeurs de densité optique (DO) ; les mesures ont été faites à la même dilution, reflétant le taux d'anticorps [27]. Les protéines rHlFBA (1 μg/puits) ont été utilisées pour recouvrir des plaques de dosage immuno-enzymatique (ELISA) pendant une nuit à 4 ° C, après quoi les plaques ont été bloquées avec de l'albumine de sérum bovin à 37 ° C pendant 1 h. Les plaques ont ensuite été incubées avec les sérums de lapin immunisé à 37 °C pendant 1 h, qui avaient été dilués en série de 1:200 à 1:204 800, puis avec des IgG anti-lapin de chèvre conjuguées à la HRP (1:10 000) pendant 1 h à 37 ° C, respectivement. Enfin, la 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine en tant que solution de substrat coloré a été ajoutée aux plaques et la réaction a été terminée avec l'addition d'une solution d'acide sulfurique. L'absorbance à OD450 a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques (Molecular Devices, Silicon Valley, CA, USA).

Au 10ème jour après la troisième immunisation des lapins (3 groupes, 6 lapins par groupe), 46 tiques adultes (23 femelles et 23 mâles) ont été lâchées dans des sacs en tissu collés sur une oreille du lapin. Le même traitement a été effectué sur l'autre oreille du lapin. Ensuite, après le détachement des tiques femelles des hôtes, le nombre de tiques piqueuses, le poids des tiques engorgées, les taux de ponte et d'éclosion des œufs ont été enregistrés. L'efficacité du vaccin (E) a été calculée comme 100 × [1–(EW × EO × EH)], où EW, EO et EH représentent le poids des tiques engorgées, les taux de ponte et d'éclosion des œufs des groupes expérimentaux/groupe témoin, respectivement [11 ].

Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel SPSS version 17.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA). Toutes les données présentées dans les figures et les tableaux ont été vérifiées quant à leur normalité. Les taux d'anticorps dans le sang prélevé dans les différents groupes au même moment ont été analysés par ELISA pour déterminer les différences entre le groupe expérimental et le groupe témoin par une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA). L'expression de HlFBA dans l'analyse qRT-PCR et les différents paramètres (poids d'engorgement, oviposition et éclosion) dans l'essai d'infestation par les tiques ont été analysés par ANOVA à un facteur suivi du test de Tukey, pour déterminer les différences entre les différents traitements. Le seuil de signification a été fixé à P < 0,05.

La longueur de l'ORF de HlFBA chez H. longicornis était de 1092 pb (KX839690.1) et encodait 363 acides aminés (aa). Plusieurs résultats d'alignement ont indiqué que la protéine HlFBA (ASV64058.1) partageait 95 %, 91 %, 90 % et 89 % de similarité avec la FBA de Dermacentor silvarum (XP_037566647.1), Ixodes scapularis (XP_029847818.1), Amblyomma variegatum (DAA34561. 1) et Rhipicephalus microplus (XP_037283106.1), respectivement. La protéine HlFBA avait 77% à 81% d'acides aminés conservés par rapport aux FBA d'autres arachnides, tels que Araneus ventricosus (GBN85837.1), Parasteatoda tepidariorum (XP_042900530.1), Varroa destructor (XP_022668058.1), Trichonephila clavipes (GFY24485 .1) et Tropilaelaps mercedesae (OQR70008.1) (Fig. 1).

Alignement des séquences d'acides aminés prédites de la protéine fructose-1,6-bisphosphate aldolase de Haemaphysalis longicornis et d'autres espèces d'Arachnida. Numéros d'accès GenBank : H. longicornis (ASV64058.1), Dermacentor silvarum (XP_037566647.1), Ixodes scapularis (XP_029847818.1), Amblyomma variegatum (DAA34561.1), Rhipicephalusmicroplus (XP_037283106.1), Trichonephila clavipes (GF Y24485.1 ), Parasteatoda tepidariorum (XP_042900530.1), Araneus ventricosus (GBN85837.1), Varroa destructor (XP_022668058.1) et Tropilaelaps mercedesae (OQR70008.1)

Les résultats de qRT-PCR ont montré que HlFBA était exprimé à différents stades de développement et que son expression chez les tiques adultes était significativement plus élevée que celle des autres stades de développement (F = 7, 196; df = 3, 8; P <0, 01; Fig. 2a). De plus, HlFBA a été trouvé dans tous les tissus détectés de tiques femelles, l'ovaire présentant le niveau d'expression le plus élevé (F = 218, 197; df = 3, 8; P <0, 01; Fig. 2b).

Modèles d'expression de HlFBA à différents stades de développement (a) et différents organes (b). Différentes lettres minuscules au-dessus des barres représentent des différences significatives à travers le groupe (P < 0,05). Les cercles représentent les points individuels de chaque groupe. Toutes les analyses ont été effectuées en utilisant trois répétitions techniques et trois répétitions biologiques. HlFBA, gène de la fructose-1,6-bisphosphate aldolase de Haemaphysalis longicornis

Le poids moléculaire de la protéine rHlFBA était d'environ 62 kDa, tel que déterminé par SDS-PAGE, la Trx du plasmide vide représentant 22 kDa (figure 3a). La protéine rHlFBA était fortement exprimée dans le surnageant induit pendant 6 h à 25 ° C et bien purifiée dans des conditions d'élution d'imidazole à 200 mM (Fig. 3b). Les résultats du western blot ont montré que seule la protéine rHlFBA réagissait positivement avec l'anti-H de lapin. longicornis sérum, indiquant ainsi sa spécificité immunogène (Fig. 3c).

Électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium–polyacrylamide (SDS-PAGE) et analyse Western blot de rHlFBA. une SDS-PAGE de l'expression de la protéine rHlFBA dans les cellules de la souche Escherichia coli BL21 induite par 0, 5 mM d'isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à 25 ° C. Lignes : 1 Production de la protéine rHlFBA sans IPTG ; 2, 3, 4, 5 production de protéine rHlFBA dans le surnageant avec IPTG à 25 °C pendant 2, 4, 6 et 8 h, respectivement ; marqueur M ; 6, 7, 8, 9 production de la protéine rHlFBA dans la précipitation avec IPTG à 25 °C pendant 2, 4, 6 et 8 h, respectivement. b Analyse SDS-PAGE de l'élution de la protéine rHlFBA. Voies : Marqueur M ; 1 production de la protéine rHlFBA avec induction à l'IPTG ; 2–6 protéine rHlFBA éluée avec 20 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM et 500 mM d'imidazole, respectivement. c Analyse Western blot de la protéine rHlFBA. Voies : Marqueur M ; 1 rHlFBA purifié par colonne de Ni incubé avec de l'anti-H de lapin. sérum longicornis; 2 E. coli induit par IPTG avec pET-32a(+)-HlFBA incubé avec du lapin anti-H. sérum longicornis; 3 rHlFBA purifié par colonne de Ni incubé avec du sérum de lapin négatif. Les flèches indiquent la protéine rHlFBA. rH1FBA, fructose-1,6-bisphosphate aldolase recombinante de Haemaphysalis longicornis

Les résultats ELISA ont montré que le niveau d'anticorps des lapins immunisés avec rHlFBA augmentait progressivement avec l'augmentation du temps d'immunisation. Le niveau d'anticorps a commencé à augmenter de manière significative le 7ème jour après la deuxième inoculation (F = 677,175 ; df = 2, 3 ; P <0,01) et a maintenu un niveau plus élevé jusqu'à la troisième inoculation (Fig. 4). Cependant, les niveaux d'anticorps dans le groupe Trx et le groupe PBS n'ont pas changé de manière significative (F = 677,175 ; df = 2, 3 ; P = 0,081).

Détection du taux d'anticorps anti-rHlFBA (fructose-1,6-bisphosphate aldolase recombinante de Haemaphysalis longicornis) dans le sérum de lapin par dosage immuno-enzymatique. Les flèches indiquent les jours des journées de vaccination. Différentes lettres minuscules représentent des différences significatives dans le groupe au moment indiqué (P < 0,05). Les cercles rouges, les carrés bleus et les triangles noirs représentent les valeurs de DO détectées par ELISA dans le groupe HlFBA, le groupe Trx et le groupe PBS à différents moments, respectivement. Toutes les analyses ont été réalisées à l'aide de trois répliques techniques et de trois répétitions biologiques

Le 10e jour après la troisième immunisation, des lapins blancs de Nouvelle-Zélande ont été provoqués avec des tiques adultes. Les différents paramètres du groupe PBS, du groupe Trx et du groupe rHlFBA ont été analysés par ANOVA à un facteur. Les résultats de l'essai d'infestation par les tiques suggèrent que le poids de l'engorgement, la ponte et l'éclosion entre le groupe PBS et le groupe Trx n'ont pas changé de manière significative au fil du temps (F = 5,258, P = 0,995 ; F = 9,331, P = 0,448 ; F = 80,895, P = 0,947, respectivement ; df = 2, 15 pour tous ; Tableau 1). Par rapport au groupe Trx, le poids moyen (± erreur standard) de la tique engorgée (F = 5,258 ; df = 2, 15 ; P < 0,05), la ponte (F = 9,331 ; df = 2, 15 ; P < 0,01) et -les taux d'éclosion (F = 80,895, df = 2, 15 ; P < 0,01) du groupe rHlFBA étaient de 142,10 ± 25,09, 36,12 ± 13,68 et 59,65 ± 1,86 %, soit une réduction de 22,6 %, 45,6 % et 24,1 %, respectivement. L'efficacité immunitaire estimée, calculée selon les paramètres ci-dessus, de la vaccination avec rHlFBA était de 68,4 %.

La fructose-1,6-bisphosphate aldolase est une enzyme clé de la glycolyse et de la gluconéogenèse, et elle est étroitement associée aux activités vitales, à l'acquisition d'énergie et aux activités métaboliques des organismes [14]. Plusieurs études ont montré qu'en plus de son rôle glycolytique normal, il joue un rôle dans l'invasion de l'hôte [28]. Dans la présente étude, nous avons effectué la caractérisation moléculaire de HlFBA de H. longicornis et estimé son efficacité à fournir une protection immunitaire aux lapins.

Prompipak et al. ont amplifié le gène FBA d'Opisthorchis viverrini par PCR et déterminé que sa séquence complète était de 1089 pb, codant pour 362 aa [15]. Li et al. ont caractérisé la FBA de Clonorchis sinensis FBA, rapportant trois ORF (CsFBA-1, CsFBA-2 et CsFBA-3) avec des longueurs de 1089, 1092 et 1092 bp, codant respectivement 362 aa, 363 aa et 363 aa [29]. Dans la présente étude, la taille de la protéine codée par HlFBA de H. longicornis était cohérente avec celles rapportées pour les espèces de trématodes parasites. L'alignement des séquences a montré que l'identité de la séquence d'acides aminés entre HlFBA de H. longicornis et celles d'autres tiques était > 89 %, mais < 81 % avec celles d'autres espèces d'Arachnida, ce qui est cohérent avec leur relation évolutive.

Yang et al. ont détecté la transcription de l'ARN messager (ARNm) de Trichinella spiralis FBA (TsFBA) à tous les stades de développement de T. spiralis [30]. Dans la présente étude, les résultats de la qRT-PCR ont montré que l'expression de HlFBA se produisait à différents stades de développement des tiques, étant la plus élevée chez les adultes. Cela peut être lié à des différences de taille individuelle et d'activité métabolique. Les tiques adultes sont plus grandes, avec une activité métabolique et des besoins énergétiques plus importants, c'est peut-être la raison pour laquelle l'expression est la plus élevée à ce stade. La différence d'expression dans différents tissus est adaptée à la fonction physiologique de chaque tissu. L'expression la plus élevée de HlFBA dans l'ovaire peut être liée à un métabolisme vigoureux et à l'activité métabolique la plus élevée au stade précoce de la formation de l'ovule. Cependant, le mécanisme spécifique nécessite une étude plus approfondie.

Comme la FBA joue un rôle central dans les activités et la survie des parasites, elle a été considérée comme un candidat vaccin potentiel ou une cible chimiothérapeutique pour le traitement [30]. Dans l'étude de Yang et al., après immunisation des souris avec le T. spiralis FBA recombinant (rTsFBA), les résultats ELISA ont montré une augmentation significative des taux d'IgG dans le groupe rTsFBA par rapport au groupe témoin. Il en est résulté une réponse immunitaire humorale et cellulaire mixte T helper 1/T helper 2 (Th1/Th2), les cellules Th2 étant prédominantes, ainsi que des taux d'IgE très élevés [30]. Dans une autre étude, lorsque des souris ont été immunisées avec la protéine FBA recombinante de Schistosoma mansoni, elles ont développé des niveaux élevés d'IgG ou d'IgG1 [31]. Un résultat similaire s'est produit dans la présente étude. Par rapport au groupe témoin, le taux d'anticorps dans le groupe rHlFBA a augmenté de manière significative le 7ème jour après la deuxième inoculation jusqu'à la troisième inoculation (P < 0,05). On peut donc conclure que l'immunisation avec la protéine rHlFBA peut inciter les lapins à produire une immunité humorale.

D'autres études ont également démontré l'efficacité protectrice de la FBA contre diverses attaques parasitaires [31, 32]. Les souris vaccinées avec rTsFBA ont montré une réduction de 48,7 % de la charge de vers adultes et une réduction de 52,5 % de la charge larvaire musculaire [30]. Ces données ont montré que le TsFBA est un antigène efficace pour développer un vaccin contre l'infection à T. spiralis. Marques et al. a lié le gène de S. mansoni FBA au plasmide pGEX-4 T-3 et sa protéine de fusion a été produite dans E. coli [31]. L'immunisation des souris avec cet antigène induit une protection significative (57 %) contre l'infection par les cercaires et la formation de granulomes hépatiques diminue significativement [31]. La FBA de S. mansoni adulte réduit également la formation de granulomes hépatiques de S. mansoni chez les souris immunisées. La FBA joue un rôle central dans la glycolyse et est importante pour la production de l'énergie nécessaire aux différentes activités et à la survie des schistosomes et elle est donc devenue une cible d'intervention [33,34,35]. Ces résultats appuient l'utilisation de la FBA comme vaccin candidat prometteur contre les parasites. Notre analyse statistique a montré que l'efficacité immunitaire du rHlFBA était de 68,4 %. Par rapport au groupe témoin, le poids des tiques engorgées, les taux de ponte et d'éclosion des œufs du groupe rHlFBA ont significativement diminué de 22,6 %, 45,6 % et 24,1 %, respectivement (P < 0,05). Une étude antérieure a montré que les anticorps présents dans le sang de l'hôte peuvent traverser l'intestin moyen de Rhipicephalus appendiculatus et conserver une activité de liaison chez la femelle adulte [36]. On peut supposer que l'anticorps peut se lier à la protéine HlFBA dans la tique et provoquer la perte de la fonction FBA. Cela entraînerait l'incapacité de la tique à obtenir de l'énergie de manière normale. Cette perte d'énergie pourrait se manifester par une réduction du poids des tiques engorgées, des taux de ponte et d'éclosion des œufs des tiques H. longicornis.

Dans une étude antérieure, nous avons constaté que la protection immunitaire de la triosephosphate isomérase (TIM) chez H. longicornis (HlTIM) était de 50,8 % [23]. La présente étude a indiqué que l'efficacité vaccinale du HlFBA (68,4 %) est supérieure à celle du HlTIM. Des titres d'anticorps plus élevés sont corrélés à la protection de l'hôte contre les infestations de tiques [37]. Cette conclusion a été confirmée par le niveau d'anticorps plus élevé du groupe HlFBA à partir des résultats de l'ELISA dans nos études. Ainsi, les taux de réduction de trois paramètres (poids d'engorgement, oviposition, éclosion) dans le groupe HlFBA (22,6 %, 45,6 % et 24,1 %) étaient supérieurs à ceux du groupe HlTIM (8,6 %, 35,4 % et 17,3 %). De plus, les fonctions physiologiques des antigènes FBA et TIM étaient différentes et le degré d'altération de la fonction médiée par les anticorps était différent. Nos résultats ont montré que le gène FBA est hautement conservé chez de nombreuses espèces de tiques et que cela serait bénéfique pour le développement d'un vaccin anti-tiques à large spectre. La réactivité croisée de cette protéine avec d'autres sérums dérivés de tiques et les expériences d'immunisation connexes doivent être analysées pour évaluer sa faisabilité pour le développement de vaccins.

La protéine rHlFBA peut notamment protéger les lapins contre l'infection à H. longicornis. La vaccination avec un seul antigène FBA peut inhiber les réponses physiologiques des tiques, affecter le développement normal des tiques femelles et protéger l'hôte. L'étude des enzymes impliquées dans le métabolisme du glucose pourrait contribuer au développement d'un vaccin à large spectre contre les tiques.

Les données soutenant les conclusions de cet article sont incluses dans l'article.

Dosages immuno-enzymatiques

Fructose-1,6-bisphosphate aldolase

FBA de Haemaphysalis longicornis

Peroxydase de raifort

Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside

Cadre de lecture ouvert

Difluorure de polyvinylidène

PCR quantitative en temps réel

Protéine HlFBA recombinante

SCT-Tween-20

Thiorédoxine

Rahman MK, Kim B, You M. Clonage moléculaire, expression et impact du silence de la protéine ribosomique S-27 chez Haemaphysalis longicornis (Acari : Ixodidae). Exp Parasitol. 2020;209:107829.

Article CAS PubMed Google Scholar

Wikel SK. Tiques et infections transmises par les tiques : écologie complexe, agents et interactions avec l'hôte. Vet Sci. 2018;5:60.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Jia N, Wang J, Shi W, Du L, Sun Y, Zhan W, et al. Des analyses comparatives à grande échelle des génomes de tiques permettent d'élucider leur diversité génétique et leurs capacités vectorielles. Cellule. 2020;182:1328–40.

Article CAS PubMed Google Scholar

Li Y, Luo J, Guan G, Ma M, Liu A, Liu J, et al. Transmission expérimentale de Theileria uilenbergi infectant pour les petits ruminants par Haemaphysalis longicornis et Haemaphysalis qinghaiensis. Parasitol Res. 2009;104:1227–31.

Article PubMed Google Scholar

Guan G, Moreau E, Liu J, Hao X, Ma M, Luo J, et al. Babesia sp. BQ1 (Lintan) : preuve moléculaire de la transmission expérimentale au mouton par Haemaphysalis qinghaiensis et Haemaphysalis longicornis. Parasitol Int. 2010;59:265–7.

Article CAS PubMed Google Scholar

Zou Y, Wang Q, Fu Z, Liu P, Jin H, Yang H, et al. Détection du groupe de fièvre boutonneuse Rickettsia chez Haemaphysalis longicornis de la province de Hebei. Chine J Parasitol. 2011;97:960–2.

Article PubMed Google Scholar

Jia N, Wang J, Shi W, Du L, Ye RZ, Zhao F, et al. Haemaphysalis longicornis. Tendances Genet. 2021;37:292–3.

Article CAS PubMed Google Scholar

Luo LM, Zhao L, Wen HL, Zhang ZT, Liu JW, Fang LZ, et al. Les tiques Haemaphysalis longicornis comme réservoir et vecteur de fièvre sévère avec le virus du syndrome de thrombocytopénie en Chine. Urgence Infect Dis. 2015;21:1770–6.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Beard CB, Occi J, Bonilla DL, Egizi AM, Fonseca DM, Mertins JW, et al. Infestation multi-états par la tique exotique vecteur de maladies Haemaphysalis longicornis—États-Unis, août 2017–septembre 2018. Morb Mortal Wkly Rep. 2018;67:1310–3.

Article Google Scholar

Wormser GP, McKenna D, Piedmonte N, Vinci V, Egizi AM, Backenson B, et al. Première morsure humaine reconnue aux États-Unis par la tique asiatique à longues cornes, Haemaphysalis longicornis. Clin Infect Dis. 2020;70:314–6.

Article PubMed Google Scholar

Galay RL, Miyata T, Umemiya-Shirafuji R, Maeda H, Kusakisako K, Tsuji N, et al. Evaluation et comparaison du potentiel de deux ferritines comme vaccins anti-tiques contre Haemaphysalis longicornis. Vecteurs parasites. 2014;7:482.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee SH, Li J, Moumouni PFA, Okado K, Zheng W, Liu M, et al. La vaccination par la subolésine inhibe l'alimentation sanguine et la reproduction d'Haemaphysalis longicornis chez le lapin. Vecteurs parasites. 2020;13:4

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang D, Xu X, Lv L, Wu P, Dong H, Xiao S, et al. Clonage génique, analyse et effet d'un nouvel homologue de la lipocaline d'Haemaphysalis longicornis comme antigène protecteur pour un vaccin anti-tiques. Vétérinaire Parasitol. 2021;290:109358.

Article CAS PubMed Google Scholar

Zhao Y, Jiao F, Tang H, Xu H, Zhang L, Wu H. Caractérisation à l'échelle du génome, évolution et profilage de l'expression de la famille de gènes FBA en réponse aux traitements à la lumière et au stress abiotique chez Nicotiana tabacum. Comportement du signal de l'usine. 2021;16:1938442.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Prompipak J, Senawong T, Jokchaiyaphum K, Siriwes K, Nuchadomrong S, Laha T, et al. Caractérisation et localisation de la fructose-1,6-bisphosphate aldolase d'Opisthorchis viverrini. Parasitol Int. Rév. 2017;66:413–8.

Article CAS PubMed Google Scholar

McCarthy JS, Wieseman M, Tropea J, Kaslow D, Abraham D, Lustigman S, et al. Onchocerca volvulus enzyme glycolytique fructose-1,6-bisphosphate aldolase comme cible d'une réponse immunitaire protectrice chez l'homme. Infect Immun. 2002;70:851–8.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pancholi V, Chhatwal GS. Enzymes ménagères comme facteurs de virulence pour les agents pathogènes. Int J Med Microbiol. 2003;293:391–401.

Article CAS PubMed Google Scholar

Wu Z, Zhang W, Lu C. Dosage immunoprotéomique des protéines de surface de Streptococcus suis sérotype 9. FEMS Immunol Med Microbiol. 2008;53:52–9.

Article CAS PubMed Google Scholar

Tunio SA, Oldfield NJ, Berry A, Ala'Aldeen DA, Wooldridge KG, Turner DP. La protéine de clair de lune fructose-1, 6-bisphosphate aldolase de Neisseria meningitidis : localisation de surface et rôle dans l'adhésion de la cellule hôte. Mol Microbiol. 2010;76:605–15.

Article CAS PubMed Google Scholar

Sun Z, Shen B, Wu H, Zhou X, Wang Q, Xiao J, et al. La fructose 1,6-bisphosphate aldolase sécrétée comme candidat vaccin à large spectre contre les bactéries pathogènes en aquaculture. Poisson Crustacé Immunol. 2015;46:638–47.

Article CAS PubMed Google Scholar

Elhaik Goldman S, Dotan S, Talias A, Lilo A, Azriel S, Malka I, et al. Streptococcus pneumoniae fructose-1,6-bisphosphate aldolase, un candidat vaccin protéique, provoque des réponses de cytokines de type Th1/Th2/Th17 chez la souris. Int J Mol Med. 2016;37:1127–38.

Article PubMed Google Scholar

Zhang TT, Zhang JC, Cui XJ, Zheng JJ, Li R, Wang F, et al. Evaluation de la protection immunitaire induite par des vaccins à ADN à partir de la paramyosine d'Haemaphysalis longicornis chez le lapin. Vecteurs parasites. 2017;10:325.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liang N, Dong HM, Fan XY, Wu YX, Yang F, Liu XY, et al. Caractérisation et évaluation d'un nouvel homologue de la triosephosphate isomérase d'Haemaphysalis longicornis comme candidat vaccin contre l'infection par les tiques. Tiques Cochez Borne Dis. 2022;13:101968.

Article PubMed Google Scholar

Zhang TT, Qiu ZX, Li Y, Wang WY, Li MM, Guo P, et al. L'expression de l'ARNm et l'activité enzymatique de trois enzymes au cours du développement embryonnaire de la tique dure Haemaphysalis longicornis. Vecteurs parasites. 2019;12:96.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Livak KJ, Schmittgen TD. Analyse des données d'expression relative des gènes à l'aide de la PCR quantitative en temps réel et de la méthode 2(-Delta Delta C(T)). Méthodes. 2001;25:402–8.

Article CAS PubMed Google Scholar

Kruger NJ. La méthode de Bradford pour la quantification des protéines. Méthodes Mol Biol. 1994;32:9–15.

CAS PubMed Google Scholar

Huercha, Song R, Li M, Fan X, Hu Z, Wu L, et al. Caractérisation de la glutathion S-transférase de Dermacantor marginatus et effet de l'antigène recombinant comme potentiel vaccin anti-tiques. Vétérinaire Parasitol. 2020;279:109043.

Article CAS PubMed Google Scholar

Hu Q, Xie H, Zhu S, Liao D, Zhan T, Liu D. Clonage, expression et caractérisation partielle du FBPA de Schistosoma japonicum, une molécule sur laquelle la douve peut développer une compétition nutritionnelle et une évasion immunitaire de l'homme. Parasitol Res. 2015;114:3459–68.

Article PubMed Google Scholar

Li S, Bian M, Wang X, Chen X, Xie Z, Sun H, et al. Caractérisations moléculaires et biochimiques de trois aldolases fructose-1,6-bisphosphate de Clonorchis sinensis. Parasitol de Mol Biochem. 2014;194:36–43.

Article CAS PubMed Google Scholar

Yang Y, Bai X, Li C, Tong M, Zhang P, Cai W, et al. Caractérisation moléculaire de la fructose-1,6-bisphosphate aldolase de Trichinella spiralis et son potentiel à induire une protection immunitaire. Front Cell Infect Microbiol. 2019;9:122.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Marques HH, Zouain CS, Torres CB, Oliveira JS, Alves JB, Goes AM. Effet protecteur et modulation à la baisse du granulome favorisés par l'antigène RP44, une fructose 1,6 bisphosphate aldolase de Schistosoma mansoni. Immunobiologie. 2008;213:437–46.

Article CAS PubMed Google Scholar

Ling E, Feldman G, Portnoi M, Dagan R, Overweg K, Mulholland F, et al. Les enzymes glycolytiques associées à la surface cellulaire de Streptococcus pneumoniae sont antigéniques chez l'homme et provoquent des réponses immunitaires protectrices chez la souris. Clin Exp Immunol. 2004;138:290–8.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tielens SA. Génération d'énergie chez les helminthes parasites. Parasitol Aujourd'hui. 1994;10:346–52.

Article CAS PubMed Google Scholar

El-Daba E, Mei H, El-Sayed A, Karim AM, Eldesoky HM, Fahim FA, et al. Clonage et caractérisation de l'isoenzyme Schistosoma mansoni fructose-1,6-bisphosphate aldolase. J. Parasitol. 1998;84:954–60.

Article CAS PubMed Google Scholar

Harrop R, Coulson PS, Wilson RA. Caractérisation, clonage et immunogénicité des antigènes libérés par les larves au stade pulmonaire de Schistosoma mansoni. Parasitologie. 1999;118:583–94.

Article CAS PubMed Google Scholar

Wang H, Nuttall PA. Excrétion de l'immunoglobuline de l'hôte dans la salive de la tique et détection des protéines de liaison aux IgG dans l'hémolymphe et les glandes salivaires de la tique. Parasitologie. 1994;109:525–30.

Article CAS PubMed Google Scholar

Ferreira Leal B, Sanchez Ferreira CA. Tiques et anticorps : la densité parasitaire et l'évasion des tiques peuvent-elles influencer les résultats suite aux protocoles de vaccination ? Vétérinaire Parasitol. 2021;300:109610.

Article CAS PubMed Google Scholar

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Nous remercions Hui Wang du Collège des sciences de la vie, Université normale du Hebei, pour son excellente assistance technique.

Cette étude a été soutenue par la Hebei Natural Science Foundation (C2021205010) et la Hebei Normal University Foundation (L2020Z06).

Yuan-Yuan Cao et Shu-Wen Xiao ont contribué à parts égales à ce travail.

Ministère de l'éducation Laboratoire clé de biologie moléculaire et cellulaire, Laboratoire clé de physiologie animale, biochimie et biologie moléculaire du Hebei, Centre d'innovation collaborative du Hebei pour l'environnement écologique, Collège des sciences de la vie, Université normale du Hebei, Shijiazhuang, 050024, Chine

Yuan-Yuan Cao, Shu-Wen Xiao, Feng Yang, Xiao-Ya Liu, Hui Lu et Yong-Hong Hu

Collège technique des postes et télécommunications de Shijiazhuang, Shijiazhuang, 050021, Chine

Jin-Cheng Zhang

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YHH a planifié et organisé l'étude et rédigé la version finale. YYC et SWX ont rédigé le manuscrit. YYC, FY et XYL ont réalisé les expériences et l'analyse des données. HL et JCZ ont collecté des échantillons, participé à l'alimentation des tiques. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Yong-Hong Hu.

Cette étude a été approuvée par le Comité d'éthique animale de l'Université normale du Hebei comme étant conforme à la loi sur la protection des animaux de la République populaire de Chine.

N'est pas applicable.

Les auteurs déclarent n'avoir aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Cao, YY., Xiao, SW., Yang, F. et al. Caractérisation moléculaire et efficacité immunitaire de la fructose-1,6-bisphosphate aldolase de Haemaphysalis longicornis (Acari : Ixodidae). Vecteurs parasites 16, 169 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05794-1

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Reçu : 29 janvier 2023

Accepté : 02 mai 2023

Publié: 25 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1186/s13071-023-05794-1

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